FluMag - SELEX


Der FluMag-SELEX ist eine Methode zur Selektion von DNA-Aptameren. Dabei wird mit fluoreszenzmarkierten ssDNA-Molekülen und mit magnetischen Beads als Immobilisierungsmatrix für das Target gearbeitet.

FluMag-Selex-Prozess
Allgemeine Darstellung des FluMag-SELEX-Prozesses zur Gewinnung von ssDNA-Aptameren
Grafik: R. Stoltenburg

Ein DNA-SELEX-Prozess besteht im Wesentlichen aus 5 Grundschritten:

  • BINDUNG: Oligonukleotidbibliothek und Target werden direkt zur Bindung gebracht
  • WASCHEN: Entfernung aller nichtbindenden Nukleinsäuremoleküle
  • ELUTION: Trennung der gebundenen Oligonukleotide vom Target
  • AMPLIFIKATION: Vervielfältigung der funktionalen DNA-Moleküle mittels PCR
  • KONDITIONIERUNG: Separation der gewünschten ssDNA aus dem doppelsträngigen PCR-Produkt

Diese Grundschritte beschreiben eine Runde des kreisförmig ablaufenden Prozesses. Zur Anreicherung bindender Moleküle werden mehrere Runden benötigt (meist 6 bis 20 Runden). Hat sich ein Oligonukleotidpool gewünschter Funktionalität angereichert, werden die enthaltenen DNA-Moleküle (Aptamere) vereinzelt und näher charakterisiert (Klonierung, Sequenzierung, Charakterisierung).

Zur Beurteilung des SELEX-Prozesses sollten die Anreicherung der bindenden und die Menge der nicht bindenden Oligonukleotide kontrolliert werden. Dazu werden beim FluMag-SELEX Fluoreszenz-Labels in die DNA-Moleküle eingeführt. Diese ermöglichen, im Gegensatz zu traditionell eingesetzten radioaktiven Markierungen, ein Arbeiten im molekularbiologischen Standard-Labor. Damit werden zusätzlichen Aufwand und erhöhte Kosten vermieden.

Eine der entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche Aptamer-Selektion ist die konsequente Trennung bindender von nicht bindenden Oligonukleotid-Strukturen. Dafür ist es günstig die Zielmoleküle auf einer festen Matrix zu immobilisieren. Die Nutzung von Magnetic Beads (paramagnetische Polysteren-Beads), erfordert den Einsatz von nur geringen Targetmengen und gewährleistet eine einfache Handhabung. Die Trennung ist effizient und stringente Waschschritte sind möglich. Magnetic Beads werden mit verschieden funktionalisierten Oberflächen angeboten. Daher sind sie für die Immobilisierung verschiedenster Targets geeignet (z.B. Peptide, Proteine, Antigene, Antikörper, Nukleinsäuren, Kohlehydrate).